プレスリリース

  代表的な天然ゴムであるアラビアガムは、非常に複雑な構造を持つ多糖であり、ある種の微生物では多くの酵素を外に出してこれを分解できます。例えば、フザリウムというカビからは、ラムノシルグルクロン酸リアーゼ（FoRhamI）という酵素が得られ、この酵素はアラビアガムの末端を切断して分解できます。高輝度光科学研究センター（JASRI）の矢野直峰研究員と東京大学大学院農学生命科学研究科の伏信進矢教授らは、総合科学研究機構（CROSS）の日下勝弘副主任研究員、大阪公立大学の近藤辰哉氏（当時）、阪本龍司教授と共同研究を行い、大強度陽子加速器施設（J-PARC）の物質・生命科学実験施設（MLF）（茨城県東海村）内の茨城県生命物質構造解析装置（iBIX）を使用して、FoRhamIの中性子結晶構造解析に成功しました。その結果、FoRhamIにはアラビアガムの中の酸性糖の部分が持つマイナスの電荷を中和する部位と糖と糖がつながる結合に水素原子（プロトン）を受け渡しするアミノ酸が存在し、これらが重要な役割を果たしていることが明らかになりました。アラビアガムは、食品、飲料、化粧品、医薬品として広く利用されており、その分解酵素のメカニズムを研究することにより、天然ゴムの物性の改変などへの利用が期待されます。

研究成果の概要

研究背景

  アラビアガムは代表的な天然ゴムであり、多くの種類の糖が結合した非常に複雑な構造を持つ多糖です。一方で、糸状菌（カビ）の一種であるFusarium oxysporum 12S株は多数の酵素を菌体外に分泌してアラビアガムを高度に分解して栄養源にできる能力を持ちます。大阪公立大学の阪本龍司教授と近藤辰哉大学院生（当時）らは、2021年にそれまで知られていなかった新しい種類の酵素として、12S株からラムノシルグルクロン酸リアーゼ（FoRhamI）を発見しました。FoRhamIはアラビアガムの末端にあるラムノース（Rha）とグルクロン酸（GlcA）という2つの糖がつながった結合を脱離反応（※1）により切断する酵素です（図1）。東京大学大学院農学生命科学研究科の伏信進矢教授と荒川孝俊助教（当時）は、阪本龍司教授らのグループと共同研究を行い、X線結晶構造解析（※2）によりFoRhamIの立体構造をすでに明らかにしています。しかし、X線の結晶構造では水素原子が観測できなかったため、この酵素の反応に最も重要な水素原子のやりとりがどのように行われるのか、また、なぜこのような脱離反応が進みやすくなっているのかという根本的なところで不明な点がありました。

図1 アラビアガムの多糖構造

  糖と糖をつなぐ結合は、α1,4-結合（α4）、α1,3-結合（α3）、β1,6-結合（β6）、β1,3-結合（β3）、などがある。FoRhamIは赤い矢印で示したRha-α1,4-GlcAの結合を切断する。

研究内容と成果

  今回、これらの研究グループは、JASRIの矢野直峰研究員と共同研究を行い、中性子結晶構造解析（※3）の手法を用いてFoRhamIの触媒反応についてさらに詳しく調べました。中性子はX線と異なり水素原子により強く散乱されるので、水素原子を可視化するのに有用です。同研究グループはFoRhamIの巨大な単結晶を作成して（図2左）、CROSSの日下勝弘副主任研究員の協力のもとで大強度陽子加速器施設（J-PARC）（※4）内の茨城県生命物質構造解析装置（iBIX）（図2右, ※5）を使用して中性子回折データを測定し、解析しました。その結果、FoRhamIの水素原子および重水素原子（※6）を含む微細な立体構造を1.80 Åの分解能（※7）で決定することに成功しました。

図2 中性子回折実験に使用した結晶と装置
左：FoRhamIの巨大結晶。重水溶液中で成長させた後に石英の筒に封入して実験に用いた。
右：J-PARC MLFの茨城県生命物質構造解析装置（iBIX）

  この酵素の脱離反応による切断には、Rha-GlcAのうち、酸性糖であるGlcAのカルボン酸の付け根にある水素原子（プロトン）の引き抜きが重要なステップであり、カルボン酸がマイナスに強く帯電することが必要であると考えられています（図3）。今回解析した中性子結晶構造には、GlcAのカルボン酸にあたる位置に、よく似た化合物である酢酸イオンが結合していました（図4左）。酢酸イオンの周囲にあるFoRhamIのアミノ酸は多数の水素原子が結合してプラスに帯電しており、マイナスのイオンを安定化していることが明らかになりました。さらに、FoRhamIのアミノ酸のうち85番目のヒスチジン（His85）がRha-GlcAをつなぐ結合に水素原子（プロトン）を受け渡しすることが、Rhaの特定の部位と水素結合（※8）していること（図4右）などから判明しました。以上の結果により、FoRhamIがアラビアガムの特定の場所を絶妙な結合の仕方と化学反応により切断して分解するメカニズムを解明することに成功しました。

図3 FoRhamIの反応機構
GlcAのカルボン酸の周囲にTyr150, Arg166, His105が存在し、いずれも水素原子を保持することによりマイナスの電荷を安定化する環境を作り上げている。His85は水素原子を受け取った後に糖をつなぐ結合に渡すことでこの脱離反応を触媒している。反応後のGlcAは二重結合を持つΔGlcAになる。

図4 FoRhamIの中性子構造
左：酢酸の周囲の様子。右：ラムノースとHis85の水素結合の様子。中性子散乱密度を青いかごで表した。各原子については、重水素はシアン（水色）、（軽）水素は白、炭素は黄、窒素は青、酸素は赤で表している。

本研究の意義、今後への期待

  アラビアガムは乳化剤や安定剤として食品や飲料、化粧品に用いられるだけでなく、錠剤のコーティング剤として医薬品などの産業分野でも広く利用されています。FoRhamIはアラビアガムの多糖の末端にあるRhaを外して酸性糖であるGlcAを露出させるため、その乳化安定能を劇的に変化させることが可能です。また、アラビアガムの多糖の特定の部分を切断する酵素はその複雑な構造を調べて生理機能を解析したり、新規オリゴ糖を生産したりするなどの利用が期待できます。本研究成果は、微生物のアラビアガム分解酵素がどのように作用するのかについて重要な基礎知識を提供するものです。

謝辞

  本研究は、茨城県の先導研究の一環としてビームタイム割り当てをはじめとする様々なサポートを受けて進められたものです。

論文情報

雑誌名	The Journal of Biological Chemistry
論文タイトル	Charge neutralization and β-elimination cleavage mechanism of family 42 L-rhamnose-α-1,4-D-glucuronate lyase revealed using neutron crystallography
著者	Naomine Yano#*, Tatsuya Kondo, Katsuhiro Kusaka, Takatoshi Arakawa, Tatsuji Sakamoto, and Shinya Fushinobu*（#筆頭著者、*責任著者）
DOI番号	10.1016/j.jbc.2024.105774

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